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熒光顯微鏡光源可以分為透射式熒光顯微鏡和反射式（落射式）熒光顯微鏡。由于透射式熒光顯微鏡存在一系列的缺點，現在已經被逐漸淘汰，由更先進的反射式熒光顯微鏡所代替。
反射式熒光顯微鏡多用高壓汞燈或鹵素燈作為光源，所用的物鏡必須能夠透過足夠的紫外光，而且本身不產生熒光，對數值孔徑沒有限制。而且，它的物鏡不僅能作為物鏡用，還可以作為聚光鏡用。落射式熒光顯微鏡既可以觀察厚的標本或不透明的標本都能觀察。
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