TIRFM系統(tǒng)的優(yōu)點及應(yīng)用

    TIRFM系統(tǒng)是全內(nèi)反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescence microscope）的英文簡稱。這類顯微鏡是用隱失波作為樣品的激發(fā)光源，并擁有高靈敏度和高時間分辨率的CCD相機（成像速率200Hz）捕捉樣品熒光，它的優(yōu)勢在于比共聚焦顯微鏡的信噪比要高，相對于其他的光學(xué)顯微鏡，它的分辨率要更高一些，并且相對于電子顯微鏡來說，對生物樣本損傷要更小，可以進行活體物質(zhì)的研究和單分子的動態(tài)研究。
    全內(nèi)反射熒光顯微鏡憑借其獨特的優(yōu)勢（它的熒光激發(fā)深度只在0～100nm的薄層范圍內(nèi)），從而被廣泛用于實時觀察單個肌漿球蛋白分子的運動、單個蛋白分子對之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、ATP酶的翻轉(zhuǎn)，聚合物內(nèi)單個分子的結(jié)構(gòu)變化、以及等離子體膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運動等方面，成為研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的zui有前途的光學(xué)成像技術(shù)。
一、在生物單分子科學(xué)領(lǐng)域，單分子熒光探測主要有三個問題：
    1）單分子發(fā)出的熒光信號通常很微弱的，所以要尋找一個足夠靈敏的探測器；
    2）由于拉曼散射，瑞利散射和雜質(zhì)熒光等產(chǎn)生的背景光，極大的干擾了信號光的探測，所以應(yīng)該盡量降低背景激發(fā)光；
    3）本體溶液產(chǎn)生的焦點熒光之外的背景光。

    這些問題都可以利用TIRFM系統(tǒng)即全內(nèi)反射熒光顯微鏡來解決！
二、觀察蛋白分子的相互作用
    1）通過熒光表識的分子共同定位，運用全內(nèi)反射熒光顯微鏡對分子間相互作用可以直接觀察，熒光共聚焦能量轉(zhuǎn)移也能夠檢測到。
    2）分子伴侶蛋白GroEL和伴侶輔助分子GroEState或者其底物乳球蛋白的相互作用已經(jīng)在單分子水平進行了很好的研究。

三、應(yīng)用于離子通道的研究
    熒光標(biāo)識的離子通道蛋白包埋到平面脂雙層中，然后用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀察。利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移或者雙視角的光鏡可以看到離子通道與其配基或者調(diào)節(jié)子之間的相互作用，同時可以在體內(nèi)跟蹤結(jié)像變化與離子電流。
四、用于DNA大分子在液-液，固-液界面的單分子吸附行為。